Cytoskeleton，Inc。很高興為藥物篩選，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞骨架研究提供廣泛的試劑盒和產(chǎn)品。我們專注于生產(chǎn)純化蛋白質(zhì)和易于使用的試劑盒，以研究生物化學(xué)和細(xì)胞過程。我們的試劑盒可用于少量樣品，用于基礎(chǔ)研究或小屏幕（Biochem Kits™），也可用于大屏幕的高通量樣品（CytoDYNAMIX Screens™）。

除了我們現(xiàn)有的產(chǎn)品，我們還在產(chǎn)品線中為微管，微管蛋白，運動蛋白，小G蛋白效應(yīng)物，GAP，GEF和其他幾種蛋白提供藥物篩選服務(wù)。

Binding Proteins

結(jié)合蛋白質(zhì)

· 概述

· 關(guān)于

· CITATIONS

· 常見問題解答

肌動蛋白與細(xì)胞中的多種蛋白質(zhì)相互作用
*，F(xiàn)-和G-肌動蛋白與細(xì)胞中的多種蛋白質(zhì)相互作用（14）??。目前有超過150種已知的肌動蛋白結(jié)合蛋白（ABP），其占細(xì)胞蛋白的約25％。ABP在肌動蛋白細(xì)胞骨架上賦予大量功能多樣性，其涉及諸如肌肉收縮，唇形突破，細(xì)胞運動，胞質(zhì)分裂和細(xì)胞質(zhì)流動的過程。研究這些過程如何調(diào)節(jié)肌動蛋白絲功能和動力學(xué)是一個重要且不斷增長的研究領(lǐng)域。

可以通過使用生物化學(xué)，遺傳學(xué)和免疫學(xué)方法分離和研究肌動蛋白結(jié)合蛋白。因為存在超過50種類型的肌動蛋白結(jié)合蛋白，所以用于鑒定它們的方法及其功能/活性也是多種多樣的。肌動蛋白親和柱通常用于親和純化ABP，無論它們是F-或G-肌動蛋白結(jié)合。可以通過利用芘肌動蛋白熒光的聚合增強來進(jìn)行顯示潛在ABP影響肌動蛋白動力學(xué)的簡單測定（參見測量肌動蛋白聚合物部分）。這種性質(zhì)的研究有助于鑒定新的肌動蛋白結(jié)合蛋白。有幾篇值得一讀的關(guān)于識別和量化新肌動蛋白結(jié)合蛋白的可能方法的評論（15,16,17）?

問題1：哪種肌動蛋白結(jié)合蛋白（ABP）可用作F-肌動蛋白結(jié)合對照？ 

答案1：肌動蛋白結(jié)合蛋白α-輔肌動蛋白（Cat。＃AT01）是一種F-肌動蛋白結(jié)合和交聯(lián)蛋白，使其可用作F-肌動蛋白結(jié)合研究的對照。它的Kd是1μM，這意味著在該濃度下發(fā)生50％結(jié)合。因此，我們的目標(biāo)是使用 2μM的α-肌動蛋白作為結(jié)合測定中的陽性對照。在結(jié)合反應(yīng)中，2μM濃度的α-輔肌動蛋白相當(dāng)于0.23μg/μl。此外，α-輔肌動蛋白對pH敏感，其高親和力發(fā)生在pH 7.0。

問題2：Cytoskeleton的肌球蛋白或重的meromyosin是否具有F-肌動蛋白活力？ 

答案2：遺憾的是，我們不會出售運動級肌球蛋白或重肌紅蛋白用于肌動蛋白運動試驗。我們發(fā)現(xiàn)質(zhì)量控制測試非常難以復(fù)制，因此我們無法充分確保試劑的質(zhì)量。因此，肌球蛋白（Cat。＃MY02和MY03）和重型meromyosin蛋白（Cat。＃MH01）不推薦用于F-肌動蛋白運動測定。已經(jīng)測試過這些試劑的客戶在運動方面沒有取得很好的成功，因此我們不建議購買樣品進(jìn)行測試。如果需要運動級肌動蛋白或重型meromyosin，我們建議遵循原始方案（Kron和Spudich，1985）并在液氮中冷凍100μl等分試樣以確保穩(wěn)定性。

    參考文獻(xiàn)：  SJ Kron和JA Spudich，1985年。熒光肌動蛋白絲在固定在玻璃表面的肌球蛋白上移動。PNAS，83,6272-6276。

SiR-Actin Kit   SiR-肌動蛋白試劑盒

50 nmol SiR-Actin and 1 umol verapamil (Cat. # CY-SC001

SiR-肌動蛋白基于結(jié)合F-肌動蛋白的天然產(chǎn)物jasplakinolide。SiR-肌動蛋白是熒光的，細(xì)胞可滲透的并且對F-肌動蛋白具有高度特異性。Sir-actin在不需要遺傳操作或過表達(dá)的情況下對內(nèi)源性F-肌動蛋白進(jìn)行染色。它在遠(yuǎn)紅色中的發(fā)射使光毒性和樣品自發(fā)熒光小化。SiR-肌動蛋白與GFP和/或m-cherry熒光蛋白相容。它可以使用標(biāo)準(zhǔn)的Cy5濾波器進(jìn)行成像。SiR-肌動蛋白可用于活細(xì)胞和組織中的寬場，共焦，SIM或STED成像。探針數(shù)量允許50 - 200染色實驗。*

光學(xué)特性

λ _腹肌    652納米

λ _EM    674納米
ε _大  1.0·10 ⁵  摩爾^-1 ·厘米^-1

*基于以下條件：0.5-1ml染色溶液/染色實驗，0.5-1μM探針濃度。通過減少體積或探針濃度可以進(jìn)一步增加染色實驗的數(shù)量。

Q1。什么是STED顯微鏡以及它是如何工作的？

A1。STED顯微鏡代表受刺激的發(fā)射消耗顯微鏡。它是一種超分辨率顯微鏡，它可以捕獲具有比傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡更高分辨率的圖像，傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡受光的衍射約束。STED使用2個激光脈沖，一個是激發(fā)熒光團的激發(fā)脈沖，使其發(fā)熒光。被稱為STED脈沖的第二脈沖通過在未被激發(fā)的中心焦斑周圍的區(qū)域中的受激發(fā)射來去激發(fā)熒光團，從而繼續(xù)發(fā)熒光。這是通過將STED脈沖聚焦成環(huán)形，即所謂的甜甜圈來實現(xiàn)的，其中中心焦點沒有STED激光脈沖，賦予熒光區(qū)域高分辨率（圖1;參見參考文獻(xiàn)1了解更多信息）有關(guān)STED顯微鏡的詳細(xì)信息）。

圖1.人原代成纖維細(xì)胞中用SiR-微管蛋白標(biāo)記的微管的STED顯微圖像。

Q2。為什么SiR肌動蛋白（或微管蛋白）探針適用于STED顯微鏡檢查？

A2。STED顯微鏡提供了在體內(nèi)研究納米極譜規(guī)模的細(xì)胞細(xì)節(jié)的能力。為了利用這種超分辨率顯微鏡，人們必須能夠以高特異性選擇使用熒光探針檢查的區(qū)域。此外，熒光探針必須是明亮的，光穩(wěn)定的，沒有或幾乎沒有光毒性，被激發(fā)并在遠(yuǎn)紅光譜中發(fā)射。另外，如果探針用于活細(xì)胞成像（從而避免細(xì)胞固定時發(fā)生的固定偽影），則需要高細(xì)胞滲透性。SiR肌動蛋白和微管蛋白探針滿足所有這些要求。簡而言之，STED和SiR探針的組合允許亞細(xì)胞肌動蛋白和微管蛋白/微管結(jié)構(gòu)的的熒光可視化及其在活細(xì)胞中的物理表征（參見圖2）。2和參考 2）。 

圖2.用SiR-肌動蛋白染色的培養(yǎng)的大鼠海馬神經(jīng)元的STED圖像。底部圖像是頂部圖像的一部分的特寫視圖，以清楚地顯示具有180nm周期性的肌動蛋白環(huán)（條紋）。感謝Elisa D'Este，MPI Biophysical Chemistry，Göttingen。

Q3。這些探頭的濾波器組是什么？

A3。使用標(biāo)準(zhǔn)Cy5過濾器可視化SiR肌動蛋白和微管蛋白探針。宜激發(fā)為650nm，發(fā)射為670nm。我們推薦激發(fā)波長為630 + 20 nm，發(fā)射波長為680 + 20 nm的濾光片（圖3）。  

圖3. SiR探針的激發(fā)（藍(lán)色）和發(fā)射（紅色）光譜。

Q4。為什么SiR探針與其他熒光團相比具有低背景？

A4。SiR探針在近紅外/遠(yuǎn)紅光譜范圍內(nèi)被激發(fā)并發(fā)光，因此避免使用較短波長，例如通常自發(fā)熒光的藍(lán)光和綠光，從而產(chǎn)生更高的背景信號。SiR偶聯(lián)探針具有兩種物理狀態(tài)：1。非熒光，封閉的關(guān)閉狀態(tài)（螺內(nèi)酯）和2.開放的，高度熒光的開啟狀態(tài)（兩性離子）。探針與其配體靶的結(jié)合有利于高度熒光的開放狀態(tài)，而游離的未結(jié)合的探針以閉合的非熒光狀態(tài)存在（圖4）。熒光擴增從未結(jié)合狀態(tài)到結(jié)合狀態(tài)是100倍。這導(dǎo)致高靈敏度的生物傳感器，其中大部分熒光僅在結(jié)合狀態(tài)下發(fā)生（參見參考文獻(xiàn)3和4）。 

圖4.SiR衍生物存在于熒光兩性離子（開放）形式（左結(jié)構(gòu)）和非熒光螺（閉合）形式（右結(jié)構(gòu)）之間的平衡中。

Q5：SiR探針在室溫下是否穩(wěn)定？

A5：是的，探頭在室溫下穩(wěn)定幾天。但是，它很大程度上取決于探針和溶劑。因此，建議將所有探針或溶液儲存在-20°C。

Q6：SiR-肌動蛋白和SiR-微管蛋白對細(xì)胞有毒嗎？

A6：是的，高于某一閾值，兩種探針都顯示出對細(xì)胞增殖和肌動蛋白或微管動力學(xué)改變的一些影響。然而，探針的毒性比其母體藥物低幾個數(shù)量級。在HeLa細(xì)胞中，肌動蛋白和微管動力學(xué)都不會在低于100 nM的濃度下發(fā)生改變。在此濃度下，SiR探針有效地標(biāo)記微管和F-肌動蛋白，從而捕獲高信噪比圖像。

問題7：探針是否適用于固定細(xì)胞？

A7：SiR-肌動蛋白探針可與PFA固定的細(xì)胞一起使用。SiR-肌動蛋白在PFA固定的細(xì)胞中標(biāo)記F-肌動蛋白與鬼筆環(huán)肽衍生物一樣有效。SiR-微管蛋白僅在乙二醇 - 雙 - 琥珀酰亞胺基 - 琥珀酸酯（EGS） - 固定的細(xì)胞中標(biāo)記微管。然而，觀察到PFA固定細(xì)胞的中心體微管的選擇性標(biāo)記。SiR-肌動蛋白和SiR-微管蛋白不適用于甲醇固定的細(xì)胞。

問題8：STORM可以成像SiR探針嗎？

A8：否 - 在STORM成像中通常使用的非常高的光強度下，在活細(xì)胞上觀察到光毒性效應(yīng)。

Q9：哪些生物和組織被SiR探針染色？

A9：此列表僅描述已報告有效的細(xì)胞系，組織或生物。細(xì)胞系，組織或生物體的省略并不意味著SiR探針不能與特定細(xì)胞，組織或生物體一起發(fā)揮作用。

智人：U2OS，成纖維細(xì)胞，HeLa，HUVEC，MCF-10A，HCT-116，A549，紅細(xì)胞

Mus musculus：C2C12，IA32，骨骼肌，原代心肌細(xì)胞，原代卵母細(xì)胞

褐家鼠：原代海馬神經(jīng)元，原代皮層神經(jīng)元，NRK

Cercopithecus aethiops：COS-7

Mesocricetus auratus：BHK

果蠅（Drosophila melanogaster）：Notum上皮細(xì)胞，S2

Didelphis marsupialis：OK細(xì)胞

Q10。SiR探針在3D細(xì)胞培養(yǎng)中起作用嗎？

A10：是的，探針能夠在3D生長環(huán)境中染色細(xì)胞。

問題11：SiR熒光團的校正因子CF ₂₆₀和CF ₂₈₀是多少？

A11：CF ₂₆₀ = 0.116，CF ₂₈₀  = 0.147

參考

1.地獄SW和Wichmann J. 1994. 通過受激發(fā)射破壞衍射分辨率極限：受激發(fā)射 - 耗盡熒光顯微鏡。選擇。快報。19,780-782。

2. D'Este E.等。2015年STED納米顯微鏡揭示了皮質(zhì)細(xì)胞骨架的周期性的活神經(jīng)元的普及。Cell Rep.10,1246-1251。

3. Lukinavicius G.等。2013年的近紅外熒光的細(xì)胞蛋白的活細(xì)胞超分辨率顯微鏡。納特。化學(xué)。5,132-139。

4. Lukinavicius G.等。2014. 用于細(xì)胞骨架的活細(xì)胞成像的熒光探針。自然方法。11,731-733。

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特色論文

“用于細(xì)胞骨架活細(xì)胞成像的熒光探針” ; G.Lukinavi?ius，L.Reymond，E。D'Este，A。Masharina，F(xiàn).Göttfert，H。Ta，A.Güther，M。Fournier，S。Rizzo，H。Waldmann，C。Blaukopf，C。Sommer， DW Gerlich，H.-D。Arndt，SW Hell＆K。Johnsson; Nature Methods 11,731-733,2014。

“STED納米顯微鏡揭示了活體神經(jīng)元中皮質(zhì)下細(xì)胞骨架周期性的普遍存在” ; E. D'Este，D。Kamin，F(xiàn).Göttfert，A。El-Hady，SW Hell; Cell Reports，第10卷，第8期，1246 - 1251，2015年。

“近紅外熒光團用于細(xì)胞蛋白的活細(xì)胞超分辨率顯微鏡檢查” ; G.Lukinavi?ius，K。Umezawa，N。Olivier，A。Honigmann，G。Yang，T。Plass，V。Mueller，L。Reymond，IRCorrêaJr，Z。Luo，C。Schultz，EA Lemke，P。Heppenstall ，C。Eggeling，S。Manley＆K。Johnsson; Nature Chemistry 5,132-139,2013。

“動態(tài)肌動蛋白絲控制人體紅細(xì)胞膜的機械行為” ; DS Gokhin，RB Nowak，JA Khoory，A。de la Piedra，IC Ghiran和VM Fowler; 摩爾。生物學(xué)。細(xì)胞; 2015年2月25日。

“可裂解的溶細(xì)胞素 - 神經(jīng)肽Y生物結(jié)合物能夠?qū)崿F(xiàn)特定的藥物傳遞并證明細(xì)胞內(nèi)作用模式” ; VM Ahrens，KB Kostelnik，R。Rennert，D.Böhme，S。Kalkhof，D. Kosel，L。Weber，M。von Bergen和AG Beck-Sickinger; J.控制。發(fā)布; 209：170-178,2015。

“紅色Si-羅丹明藥物結(jié)合物能夠在GFP細(xì)胞中成像” ; E. Kim，KS Yang，RJ Giedt和R. Weissleder; 化學(xué)。Commun。，50,4504-4507,2014。

“微管的邊緣帶在視網(wǎng)膜雙極突觸末端轉(zhuǎn)運和組織線粒體” ; M. Graffe，D。Zenisek和J. Taraska; J. Gen Physiol。卷。146 No.one：109-117,2015。

應(yīng)用筆記

“用于活細(xì)胞STED顯微鏡的明亮染料” ; S. Pitsch，I.Köster。

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