rokazyme生產和銷售用于研究，診斷和工業測試目的的新型酶。該公司成立于2006年，是冰島生物技術公司Prokaria的副產品，該公司后來合并為非營利性國有企業Matis。Prokazyme基于二十年的地熱生物勘探，微生物基因組學和酶發現。Prokazyme（作為中小企業）與馬蒂斯組成了一個研究聯盟，并共同參與了由歐盟資助的一些研究項目。持續的研發和與Matis的戰略聯盟使Prokazyme有機會開發大量不斷增長的嗜熱細菌和病毒基因數據庫，并繼續開發新的*酶產品。

ThermoPhage™ Polynucleotide Kinase – Bacteriophage RM378

ThermoPhage™多核苷酸激酶 - 噬菌體RM378

ThermoPhage™多核苷酸激酶是一種新型的熱活性激酶，在高溫下催化DNA的5'磷酸化，是僅有可用的熱穩定酶。 

ThermoPhage™多核苷酸激酶是一種新型的熱活性激酶，在高溫下催化DNA的5'磷酸化，是僅有可用的熱穩定酶。該酶具有非常低的3'磷酸酶活性。Thermophage™多核苷酸激酶非常適合各種應用，包括核酸的放射性標記（Blondal等2005，J Biol Chem 280：5188-94）

提供500個單位和1000個單位（上面選擇的產品）以及10x反應緩沖液。 

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產品：Pnk162S | 多核苷酸激酶500單位 | 價格：220.00 EUR

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產品：Pnk162L | 多核苷酸激酶1000單位 | 價格：320.00 EUR

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有關詳細信息，請參閱下文或下載產品說明書

介紹：

ThermoPhageTM多核苷酸激酶（PNK）催化磷酸（Pi）從ATP的γ-位置轉移到羥基化核酸（RNA或DNA，單鏈或雙鏈）的5'末端或將Pi交換為單體。 - 磷酸化核酸（1）。ThermoPhageTM PNK來源于感染Rhodothermus marinus的噬菌體RM378（2）。從大腸桿菌中表達并純化重組PNK蛋白。ThermoPhageTM PNK的適溫度為60-70°C。對于短的孵育時間（1小時或更短），酶的適溫度約為70°C，但對于更長的孵育方案，我們建議60-65°C。ThermoPhage PNK具有Mn2 +依賴性3'磷酸水解酶活性，不會干擾其5'激酶活性。

應用：

• 使用32P-γ-ATP標記核酸用于探針和DNA測序。

• 核酸的磷酸化用于隨后的克隆連接。

• 用于連接酶反應的寡核苷酸的磷酸化，如連接酶鏈反應和類似程序（3-4）。

• 用修飾的磷酸（即硫醇 - 磷酸）對核酸進行磷酸化，用于隨后的修飾和/或標記。

注意：   ThermoPhage PNK受高濃度（> 50 mM）鹽濃度（KCl和NaCl）的抑制，并受到磷酸根離子和銨離子的強烈抑制。標記5'磷酸化核酸（交換反應）將在與正向反應相同的緩沖液中起作用，但需要更多的時間和酶。如果使用包括RNA和RNA酶抑制劑在內的方案，請確保它們在高溫下有活性，例如SUPERase InTM（Ambion）或RNAse-Free核糖核酸酶抑制劑（CHIMERx）。

儲存：
儲存和稀釋緩沖液：10mM Tris（pH 8），50mM KCl，0.1mM EDTA，0.1μMATP，1mM DTT和50％甘油。ThermoPhageTM PNK在-25至-15°C下儲存可穩定一年。

單位定義的反應條件：
1x反應緩沖液（50mM MOPS（pH 8.5），1mM DTT，10mM MgCl 2,10mM KCl），2nmol ATP，25μg/ ml BSA，5％PEG6000,1nmol ssDNA寡核苷酸和ThermoPhageTM PNK酶在20μl體積中于70℃溫育15分鐘。

濃度和單位定義：
濃度25U /μl 
一個單位的ThermoPhageTM多核苷酸激酶催化在70℃下在30分鐘內將1nmol的γ-磷酸從ATP轉移到寡核苷酸的5'羥基化末端（5）。

應用協議：

反應方案：
對于優化的磷酸化反應方案，在25-50μl反應體積中使用10-20單位的酶與1x反應緩沖液，5％PEG6000,25μg/ ml BSA，10-100μMATP和底物。在60-70°C孵育1-2小時。
對于使用32P的標記反應，33P-γ標記的ATP使用10pmol標記的ATP，至少10pmol底物和10單位PNK，如上所述在其標準緩沖液中。在60-70°C孵育1-2小時。
如果進行交換5'激酶反應，則增加孵育時間和/或使用的酶量。

活性測定：
1x ThermoPhageTM PNK緩沖液，25μg/ ml BSA，2nmol ATP（ATP和32P-γ-ATP的混合物）和1nmol ssDNA 5'羥基化寡核苷酸寡聚物底物和20μl反應體積中的0.1-0.5單位PNK。在70℃溫育15分鐘后，通過在95℃加熱5分鐘終止反應，并將樣品在DE81濾器上捕獲并在250mM磷酸鹽緩沖液中洗滌兩次。然后將過濾器干燥并在液體閃爍計數器中計數放射性并測定磷酸鹽的摻入。

特征：

溫度穩定性：
ThermoPhageTM多核苷酸激酶在60°C時穩定，但在65-70°C的延長時間內開始失活。標準測定在50,60,65和70℃下進行，并且在0,30,60和120分鐘時取樣（圖1）。

圖1：在50-70℃下隨時間的熱穩定性。該酶在50-60℃下穩定，但在65-70℃的延長時間內開始松散活性。

溫度宜：
ThermoPhage™多核苷酸激酶的適溫度在60°C至70°C之間。我們建議70°C的孵育時間短（1小時）。如果孵育時間較長，我們建議在60°C溫育。然而，如圖2所示，對于更短的孵育時間，酶在高達90°C時顯示出相對較高的活性。

圖2：在標準測定條件下在給定溫度下孵育1小時的ThermoPhageTM多核苷酸激酶的活性。

5'激酶活性：
在標準條件下用10μMATP（32P-γ-和未標記的ATP的混合物）和20μMdA20或rA20寡聚體和5％PEG6000測定ThermoPhage多核苷酸激酶。反應時間在70℃下在10μl反應體積中30分鐘。加入終止溶液（95％甲酰胺20mM EDTA，0.05％溴酚藍和0.05％二甲苯Cyanol FF）終止反應。樣品在20％UREA-PAGE凝膠上電泳，干燥并放射自顯影。

圖3：標準條件下ssDNA（dA20）和RNA（rA20）的磷酸化。PAGE凝膠顯示使用5單位ThermoPhage PNK酶在標記反應中*耗盡ATP。

3'磷酸水解酶活性：
ThermoPhageTM PNK在pH5-7時具有宜的3'磷酸水解酶活性，主要存在于Mn2 +中，如圖4所示。主要底物是2'-3'cAMP，如圖5所示。水解酶活性不應干擾ThermoPhageTM PNK的5'激酶反應。

圖4： 2'-3'cAMP上ThermoPhageTM PNK 3'磷酸水解酶活性的pH曲線。

圖5： ThermoPhage PNK和T4 PNK在100μM2'-3'cAMP，3'TMP和dA15-PO4-底物上的3'磷酸水解酶活性的比較。

質量控制：
如下所述測定每批ThermoPhageTM多核苷酸激酶的活性和污染活性。

缺乏DNA核酸內切酶：

• 將0.25μg超螺旋pBR322 DNA與增加量的ThermoPhageTM PNK在25μl反應中于37℃和64℃溫育4小時。100U的ThermoPhageTM PNK顯示pBR322 DNA的超螺旋結構沒有松弛。

• 將0.25μgλ-DNA Eco RI / HindIII片段與ThermoPhageTM PNK在25μl反應中于37℃和64℃溫育4小時。100U的ThermoPhageTM PNK顯示沒有改變條帶圖案。

不含核酸外切酶：將
增加量的ThermoPhageTM PNK在含有[3H] - 標記的DNA的50μl測試緩沖液中于37℃和64℃溫育4小時。顯示無外切核酸酶活性的酶量至少為200單位。

缺乏Rnases：
來自Ambion的RNaseAlertTM實驗室測試試劑盒（目錄號1964）用于根據制造商的方案檢測RNase活性。在100單位ThermoPhageTM PNK孵育1小時后未檢測到RNase活性。

參考文獻：

• Sambrook，J.，Fritsch，EF和T.，M。（1989）Molecular cloning，a laboratory manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor NY。

• Hjörleifsdottir，S。等。（2002）嗜熱宿主生物的噬菌體RM 378 - 美國專li號6,492,161
•  

Blondal等人。（2005）來自噬菌體RM378的5'-多核苷酸激酶/ 3'-磷酸酶的表征-J Biol Chem 280：5188-94。

• Wu，DY＆Wallace，RB（1989）Genomics 4,560-569。

• Barringer，K。，et al。（1990）Gene 89,117-122。

• Richardson，CC（1965）Proc Natl Acad Sci USA 54,158-165。

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