BioGrammatics PS005-01說(shuō)明書

BioGrammatics—糖基化畢赤酵母表達(dá)體系

Pichia酵母菌屬的巴斯德畢赤酵母是當(dāng)今常用的單細(xì)胞真核表達(dá)體系，是載體構(gòu)建、表達(dá)、發(fā)酵和純化重組蛋白和肽的優(yōu)良體系。BioGrammatics在畢赤酵母的生命科學(xué)研究利用領(lǐng)域有著悠久的歷史和豐富的經(jīng)驗(yàn)，通過(guò)與Research Corporation Technologies（RCT）合作開發(fā)出GlycoSwitch®技術(shù)，利用該技術(shù)可以在畢赤酵母中表達(dá)的蛋白加以改性糖基化修飾。糖基化可影響蛋白質(zhì)折疊，穩(wěn)定性和蛋白質(zhì) - 蛋白質(zhì)相互作用，因此利用GlycoSwitch®技術(shù)可設(shè)計(jì)具有更多“人類”糖基化特征的蛋白質(zhì)，用以研發(fā)適用于人類的的生物藥物，以及改良常規(guī)重組蛋白質(zhì)。目前BioGrammatics可提供的基于畢赤酵母的產(chǎn)品包括快速簡(jiǎn)單的蛋白質(zhì)表達(dá)、分子表達(dá)工具下的菌株設(shè)計(jì)（如*的嚴(yán)格調(diào)控的啟動(dòng)子，的分泌基因組操作）、大規(guī)模高細(xì)胞密度酵母發(fā)酵（> 700 g / l wcw，200k升）、特定的酵母發(fā)酵條件設(shè)計(jì)、真核蛋白質(zhì)加工（折疊，分泌，糖基化）及酵母遺傳學(xué)分析等服務(wù)。

SuperMan5 (his—)

Description:

GlycoSwitch® strain, Man5 N-linked oligosaccharide structures (histidine auxotroph)

描述：

GlycoSwitch ®應(yīng)變，曼5 N-連接的寡糖的結(jié)構(gòu)（組氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型）

SuperMan5（his-），Och1-破壞與pGAP-甘露糖苷酶表達(dá)盒，殺稻瘟素抗性）。GS115（his4-），來(lái)自里氏木霉的α1,2-甘露糖苷酶，由具有殺稻瘟素抗性基因的質(zhì)粒上的GAP啟動(dòng)子調(diào)節(jié)，破壞SuperMan5基因組中的Och1基因。

BioGrammatics公司產(chǎn)品：

一、畢赤酵母表達(dá)載體

重組蛋白在畢赤酵母中的表達(dá)常見于表達(dá)載體整合到畢赤酵母基因組中，基因組整合導(dǎo)致目的基因在畢赤酵母中穩(wěn)定表達(dá)。通過(guò)大規(guī)模的表達(dá)菌株發(fā)酵可生產(chǎn)大量的目的蛋白質(zhì)。基于目的蛋白和基因的自身特異性，在載體設(shè)計(jì)時(shí)需要考慮以下因素：1）胞內(nèi)表達(dá)或者分泌表達(dá)；2）適宜的啟動(dòng)子（誘導(dǎo)型，組成型，強(qiáng)，弱）；3）選擇標(biāo)記；4）特定基因/ （開放閱讀框）ORF序列；5）表達(dá)盒在畢赤酵母基因組中適的位置。

BioGrammatics在畢赤酵母表達(dá)載體研究領(lǐng)域擁有豐富的經(jīng)驗(yàn)，創(chuàng)建并測(cè)試了大量的表達(dá)載體，以優(yōu)化數(shù)百種基因的表達(dá)和用于特定的應(yīng)用，包括細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外表達(dá)，膜蛋白的表達(dá)，高水平蛋白質(zhì)生產(chǎn)以及蛋白質(zhì)在代謝途徑中的表達(dá)和支持重組蛋白質(zhì)產(chǎn)物宜加工程度的蛋白質(zhì)。

BioGrammatics采用的pJ載體（pJ – vectors, Jeannies vectors)是4-5kb的質(zhì)粒，帶有氨芐青霉素篩選基因和“無(wú)縫”克隆方案。克隆方案基于在其識(shí)別序列之外切割的IIS型限制酶，因此，可在終表達(dá)載體中去除限制酶結(jié)合位點(diǎn)，并且可以在不多加入不需要的密碼子的情況下加入ORF。

二、畢赤酵母表達(dá)菌株

BioGrammatics提供BG和GlycoSwitch®菌株兩種畢赤酵母表達(dá)菌株系列。其中BG菌株來(lái)源于野生巴斯德畢赤酵母菌株，初于1940年由加利福尼亞的Herman Phaff分離。我們使用Illumina HiSeq技術(shù)對(duì)Phaff菌株進(jìn)行單菌落分離，成為BioGrammatics起始的原始菌株BG08，BG08在經(jīng)過(guò)改良以消除細(xì)胞質(zhì)殺傷質(zhì)粒的能力產(chǎn)生野生型表達(dá)菌株BG10。此后除了BG09之外，BG系列中的所有后續(xù)菌株均通過(guò)的BG10基因組操作衍生而來(lái)。 而BG09是BG08的一個(gè)特定變體，已開發(fā)用于在特定的胰蛋白酶切割位點(diǎn)標(biāo)記13C同位素后進(jìn)行質(zhì)譜分析。

除BG系列外，BioGrammatics還是RCT的GlycoSwitch®菌株經(jīng)銷商。 GlycoSwitch®菌株系列源于20世紀(jì)70年代的巴斯德畢赤酵母GS115菌株，是Phaff菌株的突變分離株之一，選擇用于組氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)。初的GlycoSwitch®Man5菌株來(lái)源于比利時(shí)根特大學(xué)和法蘭德斯生物技術(shù)研究所（VIB）的Roland Contreras博士，Nico Callewaert博士及其同事的合作分離。 SuperMan5菌株是由BioGrammatics研發(fā)的GlycoSwitch®Man5的后續(xù)修飾菌株，其突變體och1基因座的所有同源性區(qū)域基因已被去除以防止其通過(guò)同源重組而逆轉(zhuǎn)為野生型。

三、具有修飾糖基化的畢赤酵母菌株 - GlycoSwitch®技術(shù)。

GlycoSwitch系列菌株是與BioGrammatics與Research Corporation Technologies（RCT）合作，提供個(gè)可進(jìn)行糖基化修飾的畢赤酵母表達(dá)載體。糖基化可影響蛋白質(zhì)折疊，穩(wěn)定性和蛋白質(zhì) - 蛋白質(zhì)相互作用，因可用于設(shè)計(jì)生成具有更多“人類”糖基化的蛋白質(zhì)和生物制藥，以及改良其他類別的重組蛋白質(zhì)。其核心GlycoSwitch®菌株具有中心聚糖加工酶（OCH1），可阻止聚糖延伸，并表達(dá)外源甘露糖苷酶以將現(xiàn)有聚糖修剪成更均勻的Man5結(jié)構(gòu)。此外，BioGrammatics還可提供基于GlycoSwitch®技術(shù)的定制化研發(fā)合同服務(wù)，使用BioGrammatics公司的豐富的Pichia專業(yè)技術(shù)為客戶提供特定應(yīng)用的量身定制糖蛋白。

四、畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)培養(yǎng)基

該系列產(chǎn)品于畢赤酵母表發(fā)體系發(fā)酵培養(yǎng)或擴(kuò)增，包括干粉和濃縮液，用于配制100ml和2.5L的培養(yǎng)液。

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